Evaluación de la capacidad antiinflamatoria de compuestos tipo nitrona usando un modelo de células RAW 264.7 activadas por lipopolisacárico
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Date
2021-05-05
Authors
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Publisher
Universidad Católica de Santa María
Abstract
La inflamación es uno de los procesos biológicos más comunes de nuestro
organismo, la cual se presenta en respuesta a la presencia de cuerpos extraños. Hoy en
día la terapia antiinflamatoria está compuesta por terapias mixtas, las cuales pueden
presentar reacciones adversas, por ello la necesidad e importancia de investigar nuevos
compuestos que no presenten estas reacciones, como los compuestos tipo nitrona.
La N-oxido-5,5-dimetil-1-pirrolina, fue la primera nitrona a la que se le comprobó
propiedades antiinflamatorias, lo que llevo a la realización del presente proyecto el cual
tuvo como objetivo evaluar la actividad antiinflamatoria de nuevas nitronas en un modelo
de células RAW 264.7.
El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antiinflamatoria inducida
por lipopolisacárido de compuestos tipo nitrona en un modelo de células RAW 264.7.
El presente estudio se subdividió en tres partes: En primer lugar, se elaboró una
curva de calibración de nitrito de sodio, empleando 6 concentraciones distintas (1, 5, 10,
50, 100 y 500 μM) preparadas a partir una solución stock de 10 mM, seguido se colocaron
50 uL/pozo, se incubó la placa por 24 horas a 38 °C, y se realizó la lectura de la placa a
550 nm. Conjuntamente se preparó el LPS a partir de una solución stock de 500 ng/mL,
se realizaron diluciones seriadas a concentraciones finales de 0.5, 1, 5, 10, 50 y 100
ng/mL, estas diluciones fueron almacenadas en el refrigerador a 3 °C.
En segundo lugar, se realizó el tratamiento de las células, previamente se hizo un
cultivo celular en monocapa de células RAW 264.7 en medio completo DMEN. Se
obtuvieron 1,4x105 células vivas/mL y se colocaron 100 uL/pozo para llevar a incubación
por 24 horas a 38°C. Después de la incubación de las células se observó en el microscopio
para comprobar su adhesión en la placa, continuando con la adición de 50 uL/pozo de
LPS y la incubación de la misma a 38 °C por 24 horas. Posterior a la incubación se
procedió a realizar un ensayo de MTT, con el fin de comprobar el efecto del LPS sobre
la viabilidad celular, para poder determinar la concentración más adecuada para su uso.
Conjuntamente se realizó el ensayo de MTT con los compuestos tipo nitrona
(LQB-106, LBQ-109, LBQ-110, LBQ-124, LBQ-131, LBQ-134, LBQ-141, LBQ-467 y
LBQ-476) a una concentración del 5 %, para comprobar el efecto sobre la viabilidad
celular.
En tercer lugar, se procedió a realizar el ensayo para determinar la cantidad de
nitrito formado por las células después de haber sido activadas por LPS, se realizó un
cultivo celular en monocapa de células RAW 264.7 incubado por 24 horas a 38°C,
después se adicionó el LPS en las concentraciones óptimas, se adicionó los compuestos
tipo nitrona procediendo con la incubación por 24 horas a 38°C, para finalizar el ensayo
se preparó el reactivo de Griess mezclando por cantidades iguales el reactivo A y B,
después de la mezcla se adicionó 50 uL/pozo a la placa, se dejó incubar por 24 horas a
38°C.
Después de haber realizado una curva de calibración de nitrito por medio de
diluciones seriadas a partir de una solución stock de 10 mM en agua ultrapura se
obtuvieron 6 concentraciones diferentes 1, 5, 10, 50, 100 y 500 μM, obteniéndose una
buena linealidad (r2:0.998). Se determinó que las concentraciones de LPS más adecuadas
para activar las células RAW 264.7 son: 0.5, 1 y 5 ng/mL debido a que presentaron una
viabilidad celular por encima del 40%. A su vez se comprobó que los compuestos tipo
nitrona al 5% que fueron evaluados (C1 (LQB-106), C2 (LBQ-109), C3 (LBQ-110), C4
(LBQ-124), C5 (LBQ-131), C6 (LBQ-134), C7 (LBQ-141), C8 (LBQ-467) y C9 (LBQ-
476)), no son tóxicos para las células RAW 264.7, ya que todos presentaron una viabilidad
celular mayor al 92%.
Se observó que las células RAW 264.7 tratadas con los compuestos tipo nitrona
producen entre 5.1 y 13.2 μM de nitrito, esta concentración es 95 a 98% inferior al
producido por LPS. Finalmente se comprobó que los compuestos tipo nitrona disminuyen
considerablemente los niveles de nitrito en las células después de haber sido tratadas con
LPS a concentraciones 0.1, 1 y 5 ng/mL, entre 94 y 99% la cual es inferior al producido
por LPS a diferentes concentraciones. En este experimento, la formación de una trampa
de spin entre los compuestos tipo nitrona y los radicales libres formados por las células
activadas podría ser el mecanismo responsable de la capacidad antiinflamatoria de los
compuestos estudiados.
Description
Keywords
Nitrona, Lipopolisacárido, Medio de cultivo, Dulbecco, Griess