Aislamiento, purificación y expresión de los péptidos: N-glicosidasa F de Flavobacterium meningosepticum y Mannosil-Glicoproteina Endo-Beta-N Acetilglucosaminidasa ( Endoglicosidasa H) de Streptomyces plicatus, a partir de Escherichia coli empleando el vector pBluescript KS
Date
2024-01-03
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Publisher
Universidad Católica de Santa María
Abstract
La expresión heteróloga de proteínas ha permitido la producción de las mismas a gran escala,
sin necesidad de hacer grandes extracciones o procesos sumamente largos y complicados,
además que en la mayoría de los casos difícilmente se puede conseguir grandes cantidades
desde sus fuentes naturales.
Este trabajo de tesis tiene como objetivo contribuir en el campo de la farmacia y la
biotecnología en proteínas recombinantes con dos enzimas en particular, el Péptido: Nglicosidasa
F más conocido como PNGase y mannosil-glicoproteina endo-β-Nacetilglucosaminidasa
(endoglicosidasa H) más conocido como Endo H.
El trabajo constituye de 3 fases, la primera, la correcta identificación y transformación del ADN
que sintetiza ambas proteínas; la segunda, la correcta expresión de ellas en medio bacterial, y
la tercera, en su purificación de acuerdo a las propiedades, en este caso particular ambas con
residuos de histidina en su extremo C.
Se estudió estas enzimas, por su alta demanda en trabajo de laboratorio, por un lado, el Péptido:
N-glycosidasa F (PNGase F) es el método enzimático más eficaz para eliminar casi todos los
oligosacáridos unidos a N de las glicoproteínas. La PNGase F es una amidasa, que se escinde
entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina de oligosacáridos con alto contenido
de manosa, híbridos y complejos. Y por otro lado la endoglicosidasa H es una glucosidasa
recombinante que se escinde dentro del núcleo de quitobiosa de manosa alta y algunos
oligosacáridos híbridos de glicoproteínas N-ligadas.
Para la expresión y purificación de ambas proteínas recombinantes se utilizó el mismo método,
así como para la comparación y verificación de estas, obteniendo 6,7 mg/mL y 5,4 mg/mL de
PNGase y Endo H correspondientemente, asimismo se realizó geles SDS de poliacrilamida al
15 % para verificar las proteínas según su peso molecular, las cuales indicaron los respectivos
vi
de 29kDa y 36kDa, además se comprobó nuevamente con un Western Blot anti His,
demostrando que los métodos de aislamiento, expresión y purificación fueron precisos y
específicos para el desarrollo de las proteínas anteriormente mencionadas
Palabras claves: Expresión protéica, purificación, PNGase, Endo H, identificación,
transformación y aislamiento
Description
Keywords
Expresión protéica, Purificación, Aislamiento