Efecto de la autofagia mediada por chaperona (CMA) en la estabilidad, agregación y actividad de la proteína TDP-43 en células HEK293
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Fecha
2023-09-01
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Editor
Universidad Católica de Santa María
Nivel de acceso
Acceso Abierto
Resumen
La autofagia mediada por chaperona (CMA) es una vía catabólica lisosomal selectiva e
individual en mamíferos, cuyo fin es mantener la proteostasis celular por medio de la
degradación discriminante de toda proteína intracelular soluble poseedora de una
secuencia de motivo tipo KFERQ y que esté mal plegada, dañada o formando agregados
en el citoplasma; dentro de los substratos de CMA, está TDP-43, proteína nuclear que
regula el metabolismo del ARN, predispuesta a perder su conformación estable y a
aglomerarse en el citoplasma, debido a que posee un dominio rico en glutamina y
asparagina (Q/N) que y puede actuar como región tipo prion. El objetivo de este trabajo
de investigación fue estudiar si la estabilidad, agregación y función de la proteína TDP-43
son reguladas por la CMA.
Métodos: Se empleó la línea celular HEK293 TDP-43 WT, que sobre-expresa la proteína
TDP-43 silvestre gracias a un sistema de encendido por tetraciclina (inducción), para
realizar una transfección de los motivos KFERQ editados por mutagénesis, analizándose
la cantidad relativa de TDP-43. En segundo lugar, se utilizó el modelo celular HEK293
TDP-12xQ/N, capaz de sobre-expresar y generar agregados de TDP-43 fusionados a
repeticiones en tándem de la región Q/N, al cual se le transfectó la proteína LAMP-2A,
luego se indujo la producción de TDP-43 exógena hasta por 72 h para identificar la
distribución de las proteínas TDP-43 y LAMP-2A. En tercer y último lugar, se emplearon
las líneas celulares HEK293 Flp-In (sin sobre-expresión alguna) y HEK293 TDP-43 WT,
para generar nuevas líneas celulares que sobre-expresaran la proteína LAMP-2A, tal
como se hizo con la línea HEK293 TDP-12xQ/N L2A.
Resultados: Se generaron líneas con motivos KFERQ editados: HEK293 TDP-43
QV/AA, HEK293 TDP-43 QD/AA y HEK293 TDP-43 QV/AA + QD/AA. Se observó la
menor vida media (6 a 20 h) de TDP-43 en HEK293 TDP-43 QV/AA + QD/AA y la
mayor (8 a 174 h) en HEK293 TDP-43 QD/AA. Además, HEK293 TDP-43 QV/AA
presentó una vida media similar al control (5 a 25 h), pero, a partir de 24 h post-inducción,
manifestó un incremento sostenido. En segundo lugar, HEK293 TDP-12xQ/N, a partir de
48 h, agotó el contenido nuclear de TDP-43 e incrementó la presencia de TDP-43
citoplasmática; mientras que, se generó la línea HEK293 TDP-12xQ/N L2A y, en esta,
desde las 12 h, se observó la desaparición de TDP-43 nuclear y la acumulación de TDP-
43 en el citoplasma.
Conclusiones: Al bloquear la degradación de TDP-43 a través de la CMA editando los
motivos KFERQ, se vio que, respecto al motivo canónico QVKKD, la vida media fue
equivalente a la de TDP-43 silvestre; luego, sobre el motivo no descrito QDLKE, la
estabilidad proteica fue mayor a la del resto de líneas celulares, mientras que la doble
mutante en los motivos QVKKD y QDLKE mostró la mayor reducción en la vida media.
En cuanto a la estimulación de la CMA a través de la superproducción de LAMP-2A,
empleando el modelo celular HEK293 TDP-12xQ/N L2A, que imita la agregación de
TDP-43 y sus secuelas, no se redujo la formación de agregados de TDP-43.
Descripción
Palabras clave
Autofagia mediada por chaperona, Estabilidad, Agregación