Establecimiento in vitro de segmentos nodales de Alternanthera porrigens (Moradilla) y determinación de acido vanilico y acido cafeico mediante cromatografía liquida de alto rendimiento (RP-HPLC)
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Date
2023-11-03
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Publisher
Universidad Católica de Santa María
Abstract
En este trabajo de investigación se evaluaron las condiciones para el establecimiento in vitro y
el efecto de reguladores de crecimiento de los segmentos nodales de la especie vegetal nativa
de la región Arequipa, Alternanthera porrigens (Moradilla), y se determinó el contenido
fenólico (antioxidantes) específicamente ácido vanilico y ácido cafeico presentes en tallo y
hojas mediante cromatografía liquida de alto rendimiento de fase reversa (RP-HPLC).
Para la etapa de establecimiento in vitro de los segmentos nodales, se seleccionó el medio
Murashige & Skoog (MS), se evaluaron tratamientos de desinfección vegetal con etanol 70%
y diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (1.0%, 1.5% y 2%) donde la aplicación
de etanol 70% con NaClO 2.0 % durante 2 y 7 minutos, respectivamente, presentó mayores
porcentajes de viabilidad. Una vez obtenido el método más eficiente de desinfección vegetal,
se realizó la etapa de propagación in vitro de segmentos nodales en medio de cultivo sólido
MS suplementado con reguladores de crecimiento 6-bencilaminopurina (BAP) y ácido 3-
indol-acético (AIA) con el objetivo de evaluar los efectos en la elongación del tallo y
generación de brotes (yemas axilares y apicales) bajo condiciones de luz durante 20 días a 20
± 3°C. Los medios MS se suplementaron con 0 (testigo), 0.1, 0.5 mg/L de AIA y 0, 0.5 y 1
mg/L de BAP donde el tratamiento con concentraciones 0.5 mg/L AIA y 1 mg/L BAP fue la
combinación de fitohormonas que presentó resultados óptimos para esta etapa.
Posteriormente, se realizó una extracción sólido-líquido utilizando el equipo Soxhlet para la
determinación de fenoles totales mediante el método Folin-Ciocalteu en el que se obtuvo un
valor de 6.81 mg EAG/g de extracto de moradilla, equiparable a valores reportados en otros
trabajos con la misma especie vegetal.
Así mismo, se evaluó los compuestos fenólicos ácido vanilico y ácido cafeico presentes en
hojas y tallo de Alternanthera porrigens mediante cromatografía liquida de alto rendimiento
de fase reversa (RP-HPLC). Se inició por la preparación de los extractos vegetales, donde 1g
de peso seco (ps) de la planta (hojas y tallo) fue diluida en metanol: agua: TFA (50:50:0.1)
seguido de 30 min de sonicación a temperatura ambiente, luego se centrifugó a 3000 rpm
durante 5 min y se filtró con filtros RephiQuik nylon 0.45 μm.
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Además, se realizó la preparación de los estándares de ácido vanilico y ácido cafeico para
obtener la curva de calibración. Los estándares y las muestras vegetales fueron identificados
mediante HPLC, empleando una columna RP-18.
La separación cromatográfica se corrió a un flujo de 1000 μl.min-1, con un volumen de
inyección de 20μL y una fase móvil que consistió en lo siguiente: una mezcla del eluyente A
(agua ultrapura más TFA) y eluyente B (Metanol más TFA). La gradiente utilizada fue la
siguiente: 0 min, 75% de A y 25% de B; 5 min, 75% de A, 25% de B, 15 min, 55% de A y
45% de B, 30 min, 20% de A y 80% de B, 40 min, 75% de A y 25% de B a una longitud de
onda de entre 254 nm. Los ensayos se realizaron por duplicado.
Finalmente, con este análisis se logró determinar y cuantificar ácido vanilico y ácido cafeico
obteniendo 67.83 ppm AV/g y 26.53 ppm AC/g, respectivamente, de los extractos preparados.
Description
Keywords
Alternanthera porrigens, Compuestos fenólicos, propagación in vitro